（1）取四周龄SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

（2）碘酒镍拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的锡子和剪刀分离大腿腿骨，尽可能去除筋膜、肌肉和结缔组织；从关节处分离出软骨组织，将其剪成小于1mm3的组织块，用含双抗的PBS溶液冲洗两遍。

（3）软骨组织块静置5min， 弃去上层液体及悬浮组织， 往离心管中加3 体积的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化15-20min；

（4） 4℃静置5min； 弃上清， 加入0.2%胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中， 振荡消化30~60min；

（5）加入生长培养基终止消化，反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液，1200rpm离心8min，弃上清，用DMEM完全培养基重新暴浮细胞，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

（6）放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。每3天更换培养液至第5天改为无血清培养液。免疫组化鉴定原代细胞。细胞形态

膝关节软骨原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞三角或多角形，生长缓慢，培养3-5天进入快速增殖期。