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大鼠脊髓神经元细胞的分离及培养

大鼠脊髓神经元细胞的分离及培养

1、培养板的包被(1)将盖玻片裁成0.5cm0.5cm大小,洗洁精浸洗、烘干。(2)经5%盐酸浸泡30min,自来水冲洗20min,三蒸水冲洗,浸泡过夜并烘干;移入95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干,放入24孔细胞培养板。(3)用0.01%...

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1、培养板的包被

1)将盖玻片裁成0.5cm×0.5cm大小,洗洁精浸洗、烘干。

2)经5%盐酸浸泡30min,自来水冲洗20min,三蒸水冲洗,浸泡过夜并烘干;移入95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干,放入24孔细胞培养板。

3)用0.01%L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片,37℃恒温孵育4h或常温过夜。吸弃L-多聚赖氨酸溶液,灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片,晾干备用。2、大鼠脊髓神经元细胞的分离及培养

175%(体积分数)酒精消毒新生24h内的健康SD大鼠,在无菌条件T下断头,分离并切取脊髓,置于盛冷的pH7.2,无钙、镁的D-Hank's液的平皿中(下置冰袋)。

2)无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。

3)用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的组织块,0.125%胰蛋白酶消化,37℃作用10min,期间振摇2~3次。

4)巴斯德吸管轻轻吹打20次,静置5min,将细胞上清移入新的无菌离心管,加入完全接种液终止消化。则余组织按照上述步骤继续消化,重复2-3次,制成细胞悬液。

5)将新的离心管中细胞悬液,离心(1000r/min10 min4℃),弃去上清液。加入完全培养液重悬,200 目不锈钢网过滤。

6) 将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以8.0×1041.0×105/mL的密度将细胞以400μl/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板

7)置37℃5%CO2培养箱培养4~6h,全量更换为无血清培养液。

8)体外培养第3天,加入Ara-C 工作液,以抑制非神经细胞过度增殖,作用24h后吸出。(9)此后每3d半量换液1次,体外培养第7~21天的细胞用于实验。